- Criada por Kary Banks Mullis, em 1983, a técnica PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reação em Cadeia da Polimerase) é usada para amplificar “in vitro” uma região específica de DNA. Este método é utilizado para produzir diversas cópias de uma determinada parte do DNA para diferentes análises.
- A aplicação é ampla, por exemplos, nas clínicas, para fins diagnósticos; na identificação de seres vivos ou mortos, a partir de amostras mínimas de tecido (fio de cabelo, gota de sangue etc.) e em biotecnologia.
Etapas do processo de PCR- Desnaturação: a separação da dupla fita de DNA ocorre em temperatura de 95ºC.
Hibridização: nesta etapa a temperatura pode variar entre 60 e 64ºC. Os primers fazem a ligação com as sequências complementares da região que se pretende amplificar do DNA. Eles servem como indicadores para a enzima polimerase.
Polimerização: este processo deve ser iniciado com a temperatura de 72ºC. A tag polimerase liga-se a fita sinalizada pelo primer, complementando-a, e inicia a sequência que será replicada, formando novamente uma fita dupla de DNA.
Este ciclo é realizado cerca de 40 a 60 vezes promovendo a amplificação de determinada região que se pretende analisar.
qPCR ou PCR em Tempo Real- Considerada uma variação da técnica convencional de PCR, a PCR em Tempo Real (Real Time Quantitative PCR) permite que a amplificação e detecção ocorram simultaneamente. A tecnologia qPCR apresenta excelentes vantagens e por isso é mais utilizada se comparada aos métodos convencionais.
Por meio dela é possível visualizar o resultado, em tempo real, durante o procedimento de amplificação, o processo é rápido, o risco de contaminação é baixo e ainda é capaz de gerar resultados quantitativos com maior precisão.
Durante a amplificação, a quantificação é determinada pela quantidade de produto amplificado durante cada ciclo, através da fluorescência emitida. Esta metodologia utiliza um equipamento com sistema de monitoramento da emissão da fluorescência
- Para que os resultados sejam precisos é necessário utilizar equipamentos confiáveis, com propriedades óticas específicas para que o aparelho não interfira na emissão ou leitura da fluorescência. Se algum problema acontecer neste cenário, o resultado sairá errado.
